Construction du gène synthétique codant pour FHS-OGOX1 par des outils bioinformatiques
Le gène codant pour l’isoforme mature OGOX1.2 de Arabidopsis thaliana (AT4G20830.2) a été fusionnée en aval de la séquence SUMOstar développée par LifeSensor Inc. (https://lifesensors.com/) qui comprenait également les séquences codant pour les balises FLAG- (DYKDDDDK) et 6xHis (HHHHHH) (https:/ /lifesensors.com/wp-content/uploads/2019/09/2160_2161_Pichia_SUMOstar_Manual-1.pdf). La séquence du gène chimère, appelée ici FHS-OGOX1a été optimisé en codons avec l’utilisation de codons de Pichia pastoris en utilisant l’outil en ligne OPTIMIZER (http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/)26 et a été entièrement synthétisé par Genescript (https://www.genscript.com/) en ajoutant les bases des sites de restriction PstI et XbaI au 5je et 3je extrémités, respectivement, du gène. Le gène a ensuite été cloné dans le vecteur d’expression pPICZαB (Invitrogen, San Diego, USA) en phase avec la séquence codant pour le facteur α de levure pour la sécrétion de protéines recombinantes dans le milieu.
Expression hétérologue des FHS-OSOX dans P. pastoris
Le FHS-CELLOX recombinant, c’est-à-dire une forme flag-his-sumoylée de CELLOX de A. thaliana (AT4G20860), a été exprimé et purifié comme décrit précédemment11. La construction pPICZαB/FHS-OGOX1 a été transformée en E. coli Cellules compétentes DH5α (ThermoFisher, Waltham, USA) pour l’amplification plasmidique. Ensuite, la construction a été linéarisée par SacI et introduite dans P. pastoris par électroporation27. Les transformants multi-copies ont été sélectionnés sur milieu YPDS solide [1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) dextrose, 1 M Sorbitol] avec la zéocine comme marqueur de résistance aux antibiotiques (1 mg.mL−1). Pour l’expression des protéines, plusieurs colonies de multicopie P. pastoris les transformants ont été inoculés dans 5 mL de milieu YPD [1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) dextrose] complété avec 0,2 mg.mL−1 zéocine et incubé à 28 °C dans un agitateur rotatif à 180 tr/min pendant 72 à 96 h. Les cultures ont ensuite été centrifugées et les culots cellulaires ont été remis en suspension dans 1,5 mL de Buffered Minimal Medium. [0.1 M K-phosphate (pH 6.0), 1.34% (w/v) YNB, 4 × 10–5% (w/v) biotin and 0.5% (v/v) methanol] pour induire l’expression de FHS-OGOX1 et les laisser pousser pendant 48 h supplémentaires. Pour détecter l’expression de FHS-OGOX1 recombinant, différents filtrats de culture ont été évalués par SDS-PAGE/coloration au bleu de Coomassie. Pour la purification de FHS-OGOX1, le filtrat de culture induit par le méthanol du transformant le plus exprimant a été soumis à un échange de tampon (50 mM Tris – HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM 2-mercaptoéthanol et 10 mM imidazole) puis chargé sur un Colonne HisTrap HP (ThermoFisher, Waltham, USA). Les fractions éluées contenant FHS-OGOX1 ont été regroupées et dialysées dans 50 mM Tris – HCl pH 7,5, 100 mM NaCl et 100 mM (NH4)2DONC4. Avant son utilisation dans les tests, la préparation de FHS-OGOX1 dialysée a été quantifiée par absorbance UV-visible, puis analysée par SDS-PAGE/coloration au bleu de Coomassie. Pour le spectre UV-visible, le FHS-OGOX1 pur a été analysé par NanoDrop One (Thermo Fisher, Waltham, USA) avant et après concentration (~ 3X) à l’aide d’un concentrateur centrifuge Vivaspin 500 (30.000 MWCO PES) (Sartorius, Gottinga, Allemagne) . Le degré de pureté de la préparation protéique a été calculé comme [(moles FAD.moles FHS-OGOX1–1) × 100%] (DCP, ε450nm= 11 300 millions−1.cm−1; FHS-OGOX1, ε280nm = 78 270 millions−1.cm−1). L’activité de FHS-OGOX1 a été évaluée en utilisant le test xylénol orange6. L’activité de FHS-OGOX1 a été dosée dans 50 mM d’acétate de Na pH 5,0 et 50 mM de NaCl en utilisant des OG, OG3 ou OG4 (15 µM) comme substrats en présence de l’enzyme purifiée (4 nM), puis exprimée en µmoles de H2O2 généré par minute par mg de FHS-OGOX1. Le mélange OG (degré de polymérisation : 10-15 ; valeur moyenne utilisée pour la conversion masse-mole : 2 306 g.mol−1) et OG3 ont été achetés chez Biosynth Carbosynth (https://www.carbosynth.com/) tandis que OG4 a été acheté chez ELICYTIL (https://www.elicityl-oligotech.com/). Pour chaque solution mère d’oligomère de galacturonan (1 mM), la quantité d’extrémités réductrices a été confirmée par le dosage des sucres réducteurs28 en utilisant différentes quantités d’acide galacturonique comme courbe d’étalonnage. Tous les dosages enzymatiques décrits dans ce travail ont été réalisés à pH apoplastique (5.0) et en utilisant une concentration d’oligosaccharides (15 µM) compatible avec celle utilisée pour déclencher les réponses de défense chez les plantes.13.
Evaluation de l’activité FHS-OGOX1 par dosages couplés ABTS-HRP et xylénol orange
Au préalable, l’activité oxydante OG de FHS-OGOX1 a été mesurée par deux méthodes spectrophotométriques différentes, à savoir le test couplé ABTS-HRP13 et le dosage du xylénol orange6. Dans les deux tests, l’activité de FHS-OGOX1 a été évaluée dans 50 mM d’acétate de Na pH 5,0 et 50 mM de NaCl en ajoutant des OG ou OG4 (15 µM) comme substrats en présence de l’enzyme purifiée (4 nM) sans agitation. Dans le test couplé ABTS-HRP, la réaction enzymatique (0,2 ml) comprenait également l’ABTS (100 µM) et le type HRP VI-A (0,05 gL−1) (P6782, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) alors que l’absorbance à 415 nm a été mesurée en mode continu, soustraite à celle de la réaction témoin (mélange basal) puis convertie en µmol ABTS·+ (ε415nm = 36 mM−1.cm−1). Conversion de µmol ABTS·+ en µmol H2O2 a été obtenu en appliquant le facteur de conversion [1.92 molecules ABTS·+: 1 molecule H2O2]29. A la différence du dosage couplé ABTS-HRP, le dosage du xylénol orange est une méthode à point final6. Selon30les réactions enzymatiques (0,1 mL) ont été incubées sans agitation puis bloquées par l’ajout d’un volume de « solution révélatrice xylénol orange » [1 M sorbitol, 0.001 M xylenol orange, 0.0025 M (NH4)2Fe(SO4)2, 0.25 M H2SO4], entraînant ainsi une chute drastique du pH et une inactivation des enzymes. L’absorbance à 560 nm des mêmes réactions enzymatiques a été mesurée à sept moments différents (0, 2, 4, 8, 16, 20 et 40 min), soustraite à celle de la réaction témoin (mélange basal) et convertie en µmol H2O2par interpolation avec le H2O2-courbe d’étalonnage. Toutes les analyses ont été réalisées en triple à 25 °C.
Évaluation de l’activité de balayage des FHS-OSOX par ABTS·+-test de réduction
Dans l’ABTS·+-test de réduction, la concentration de départ d’ABTS (110 µM) a été convertie en 90 µM d’ABTS·+ et 20 µM ABTS en utilisant K2 S2O8comme agent activateur d’ABTS. K exhaustif2S2O8 -l’oxydation médiée de l’ABTS a été obtenue en incubant la réaction pendant 16 h à 25 ° C. A la fin de l’incubation, la quantité d’ABTS·+ a été déterminée par absorbance à 415 nm (ε415nm = 36 mM−1.cm−1). La réaction enzymatique (0,2 ml) a été évaluée dans 50 mM d’acétate de Na pH 5,0 et 50 mM de NaCl, en ajoutant le FHS-OGOX1 purifié (4 nM) et les OG ou l’oligomère de galacturonan approprié (OG4, OG3) (15 µM) ou , alternativement, en ajoutant le FHS-CELLOX purifié (16 nM) et le CD approprié (CD4 ou CD3) (15 µM). oxOG4 a été préparé à partir d’OG4 comme décrit précédemment6 tandis que CD4 et CD3 ont été achetés auprès de Megazyme (Bray, Irlande). Pour chaque solution mère de galacturonane et de CD (1 mM), la quantité d’extrémités réductrices a été confirmée par le dosage des sucres réducteurs28 en utilisant différentes quantités de glucose comme courbe d’étalonnage. Pour évaluer la production de H2O2 dans l’ABTS·+-essai de réduction, HRP a été ajouté à chaque réaction (1,25 uM). Pour déterminer la réduction de l’ABTS·+ au cours du temps, l’absorbance à 415 nm des réactions enzymatiques a été mesurée en mode continu, soustraite à celle de la réaction témoin (mélange basal) puis convertie en µmol ABTS·+ (ε415nm = 36 mM−1.cm−1). En parallèle, le dosage du xylénol orange a été utilisé pour mesurer la quantité de H2O2 produit par FHS-OSOX dans les mêmes conditions de réaction [50 mM Na-Acetate pH 5.0 and 50 mM NaCl, pure FHS-OGOX1/CELLOX (4/16 nM) and the appropriate oligosaccharide (15 µM)]. Toutes les analyses ont été réalisées en triple en utilisant un Infinite® Spectrophotomètre M Nano200 (Tecan AG, Männedorf, Suisse).
Évaluation de l’activité ABTS-oxydante de la laccase fongique en présence de FHS-OSOX et d’oligosaccharides courts
L’activité ABTS-oxydante de la laccase de Tramètes versicolor (38429, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a été évaluée dans 50 mM d’acétate de Na pH 5,0 et 50 mM de NaCl, en utilisant le test d’oxydation ABTS (100 µM ABTS) en présence des quatre FHS-OGOX1/ OG4, combinaisons FHS-OGOX1/OGs, FHS-CELLOX/CD3 et FHS-CELLOX/CD4. L’activité a été dosée en utilisant la laccase seule (5 µg.mL−1) ou en présence de FHS-OGOX1 (4 nM) et OGs/OG4 (15 µM), ou en présence de FHS-CELLOX (16 nM) et CD3/CD4 (15 µM) dans un volume réactionnel final de 0,2 mL . Pour le test d’oxydation ABTS, la quantité d’ABTS·+ a été mesurée par spectrophotométrie à 25 °C après l’absorbance à 415 nm, soustraite à celle de la réaction témoin (mélange de base) et convertie en µmoles d’ABTS·+ (ε415nm = 36 mM−1.cm−1). En parallèle, le dosage du xylénol orange a été utilisé pour mesurer la quantité de H2O2 produit par les FHS-OSOX en présence de laccase (5 µg.mL−1) dans les mêmes conditions de réaction [100 µM ABTS, 50 mM Na-Acetate pH 5.0 and 50 mM NaCl, pure FHS-OGOX1/CELLOX (4/16 nM) and the appropriate oligosaccharide (15 µM)] dans un volume réactionnel final de 0,1 mL. Toutes les analyses ont été réalisées en triple à 25 °C.
Analyse des CD3 résiduels par HPLC
La quantité de CD3 résiduel lors de l’oxydation avec FHS-CELLOX a été déterminée par HPLC. En raison de la limite de détection de notre analyse HPLC, les concentrations d’OSOX/oligosaccharide ont été augmentées en maintenant le même rapport de réactions précédemment décrites. Dans nos conditions expérimentales, seul le CD3 était détectable alors que le CD3 correspondant (acide) oxydé par CELLOX (ie Glc1–4βGlc1–4Gluconic acid7) était indétectable, vraisemblablement retenu par la colonne. Pour l’analyse des CD3 résiduels en présence d’ABTS·+FHS-CELLOX (0,7 µM) et CD3 (600 µM) ont été incubés sans agitation pendant 0,5, 4, 8 et 16 min dans un tampon composé de 50 mM Na-Acetate pH 5, 50 mM NaCl et 1 mM ABTS·+/ABTS (800/200 µM) (0,2 mL). Pour l’analyse des CD3 résiduels dans la réaction témoin (c’est-à-dire sans ABTS·+), les réactions enzymatiques ont été réalisées dans les mêmes conditions réactionnelles mais sans l’ABTS·+/mélange ABTS. Afin d’évaluer l’effet de H2O2sur l’activité de FHS-CELLOX, de la catalase de foie bovin (4 µg) (C1345, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a été ajoutée à la réaction. Les réactions ont été réalisées à 25 °C puis inactivées par la chaleur (90 °C × 10 min) avant l’analyse, à l’exception de la réaction avec le temps d’incubation le plus court (soit 0,5 min) qui a été immédiatement injectée. L’analyse HPLC a été réalisée à l’aide d’un système Shimadzu LC-2030 Plus Prominence-i (Japon) équipé d’un détecteur à indice de réfraction différentiel Shimadzu (RID-20A). La séparation chromatographique a été réalisée à l’aide d’une colonne Knauer Eurokat-Pb (300 × 4 mm, granulométrie 10 µm). La phase mobile consistait en une élution isocratique à l’aide d’eau distillée (éluant A). Le volume d’injection pour tous les échantillons était de 40 µL, tandis que le débit et le temps de séparation chromatographique étaient de 0,4 mL.min−1 et 15 minutes, respectivement. L’éluant A a été filtré à travers un filtre de taille de pores de 0,2 μm. La température de la colonne a été maintenue à 75°C. Le logiciel Shimadzu LabSolutions a été utilisé pour l’acquisition de données, le contrôle des instruments et l’analyse des données. Les chromatogrammes représentés sur la figure 5 ont été obtenus en soustrayant les chromatogrammes de la réaction complète à ceux de la réaction basale (c’est-à-dire la réaction sans le substrat).
Tags: Activité piégeage des cations radicaux des oligosaccharides oxydases type enzyme pont berbérine agissant sur courts fragments paroi cellulaire
.
